Лиллемор Матссон Хюльтен, Марк Холмстрём, Басам Сусси

Влияние энергии синглетного кислорода на генерацию активных форм кислорода человеческими моноцитами.

Лаборатория сердечно-сосудистых исследований им. Валленберга, Университет Гетеборга,

Сальгренская университетская больница, Гётеборг, Швеция
Free Radical Biology & Medicine, том 27, №№. 11/12, стр. 1203-1207, 1999
Аннотация – реакционноспособный и опасный синглетный кислород может приносить пользу в момент перехода в основное триплетное состояние O2. Энергия возбужденного состояния при этом излучается в виде света с длиной волны 634 нм. В настоящем исследовании рассматривается влияние такой энергии (в форме светового облучения или передачи энергии через воздух) на продукцию человеческими моноцитами активных форм кислорода (АФК), которая измерялась по интенсивности хемилюминесценции при использовании изолюминола. Было продемонстрировано 60%-ое снижение выделения АФК моноцитами при стимуляции форболмиристатацетатом (ФМА) после 2-минутного облучения. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии энергии синглетного кислорода на поведение клеток invitro. © 1999 Elsevier Science Inc.
Введение
Кислород — это широко распространенный и многоликий химический элемент. Наиболее распространенная и важная его форма — стабильный молекулярный кислород O2, без которого невозможен метаболизм аэробных клеток. Еще один лик кислорода — возбужденные молекулы с неспаренным электроном, т.е. весьма нестабильные и агрессивные свободные радикалы. Эти активные формы участвуют в широком спектре токсических механизмов в биологических организмах. При возбуждении молекулы O2 из основного в более высокое энергетическое состояние образуется синглетный O2. Эта форма кислорода также опасна для биологических систем [1]. Синглетный кислород может образовываться фотохимическим путем, в результате передачи энергии от возбужденного фотосенсибилизатора.
Применению антиоксидантов и ферментов-ловушек были посвящены многочисленные исследования, цель которых состояла в том, чтобы предотвратить или снизить токсический эффект различных форм кислорода [2-6]. Природные ферменты-ловушки, в том числе супероксид-дисмутаза (СОД) и каталаза, демонстрируют эффективность
Хотя синглетный кислород относят к высокоактивным формам этого вещества с подтвержденной токсичностью для биологических систем, излучаемая им энергия может оказаться полезной. Фоточувствительность присутствует в биологических системах на различных уровнях [7].
Очень привлекательна идея использовать перенос энергии из одного места в другое с целью модификации той или иной системы. Будем называть энергию, излучаемую синглетной молекулой кислорода при переходе в основное состояние, энергией синглетного кислорода (ЭСК).
Настоящее исследование посвящено изучению влияния передачи ЭСК с длиной волны 634 нм в форме светового облучения или передачи энергии через воздух на генерацию активных форм кислорода (АФК) человеческими моноцитами с помощью метода хемилюминисценции в присутствии изолюминола [8, 9].
 
Материалы и методы
Выделение человеческих моноцитов
Одноядерные клетки извлекались из лейкоцитных пленок с помощью процедуры Ficoll-Hypaque [10]. Выделение моноцитов проводилось по модифицированной многоступенчатой адгезионной методике [11]. Коротко говоря, флаконы для культивирования клеток (Nunclon; Nunc, Naperville, IL, USA) в течение часа подвергаются предварительной обработке 5 мл деактивированной нагреванием сыворотки крови при комнатной температуре. Затем сыворотка сливается, а флаконы высушиваются на воздухе. Одноядерные клетки высеваются с плотностью 107 клеток/мл. После часовой инкубации при 37°C и концентрации CO2 5% незакрепившиеся клетки смываются физраствором с фосфатным буфером (phosphate-bufferedsaline, PBS). Для отделения моноцитов от поверхности производится инкубация в 5 мл PBSс добавлением 5 мМ этилендиаминтетраацетата и 2% инактивированной человеческой сыворотки при 4°C в течение 20 минут. Отделенные моноциты собирают, промывают и помещают в виде взвеси в фосфатный буферный раствор Кребса-Рингера с добавлением глюкозы (KRG; SigmaChemicalCompany, St. Louis, MO, USA). После подготовки препарат моноцитов хранят на водяной бане со льдом и отбирают образцы для измерения уровня клеточной хемилюминесценции.
Действие энергии синглетного кислорода
Энергия синглетного кислорода генерировалась с помощью аппаратуры Valkion (Гётеборг, Швеция), в форме воздуха в одном устройстве и в форме оптического излучения (с использованием оптоволокна) в другом. В аппаратуре Valkionсинглетный кислород генерируется с применением хорошо известного фотосенсибилизирующего красителя [12]. Источником света служит галогенная лампа с широким спектром излучения. В используемой среде генерации — воздухе повышенной влажности — время жизни синглетного кислорода составляет около 2 мкс. Клетки подвергались воздействию энергии синглетного кислорода путем пропускания активированного воздуха через пробирку либо путем освещения с длиной волны λ=634 нм, после чего с помощью люминометра измерялась интенсивность генерации АФК. Как облученные, так и необлученные контрольные клетки содержались при температуре 37°C. Для оценки жизнеспособности клеток использовался краситель трипановый синий.
Измерение интенсивности хемилюминесценции
Интенсивность хемилюминесценции (ХЛ) измеряли по двум-трем образцам при 37ºC с помощью люминометра Bio-Orbit1251 и программного обеспечения Multi-Use (Bio-OrbitOy, Turku, Finland), используя одноразовые пробирки из полистирола с 1 мл реакционной смеси. Среда для измерения внеклеточной хемилюминесценции содержала клетки, 56 мкМ изолюминола (6-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) и 4 ед. пероксидазы хрена (ПХ). В некоторых экспериментах добавлялась также каталаза (2000 ед/мл) и СОД (50 ед/мл). Для активации НАДФН-оксидазы (восстановленный никотинамид-адениндинуклеотидфосфат – оксидазы) непосредственно перед помещением пробирок в люминометр добавлялся форболмиристатацетат(ФМА) [13] до конечной концентрации 10 нМ. Интенсивность ХЛ регистрировалась как функция времени. Если не указано иное, результаты представляют собой максимальное значение в милливольтах на 5 x 105 жизнеспособных клеток. Статистический анализ проводился с применением теста Стьюдента.
Результаты
Моноциты человека инкубировались под воздействием ЭСК, а затем подвергались стимуляции ФМА. Измерялась реакция в форме ХЛ с использованием изолюминола. Оценка продукции АФК как функции времени показала вызванное воздействием ЭСК снижение как пиковой, так и общей интенсивности ХЛ. Зависимости ХЛ под действием ФМА от времени для обработанных ЭСК и контрольных клеток были аналогичны; пик достигался через 2-3 минуты после добавления ФМА.
Моноциты, инкубированные при воздействии ЭСК в форме пропускания пузырьков воздуха в течение 10 минут, значительно снижали продукцию активных форм кислорода по сравнению с контролем: 249 ± 24,7 мВ/5 x 105клеток против 346 ± 24,3 мВ/5 x 105клеток (среднее ± стандартное отклонение по 10 различным донорам клеток, p=0,001). В случае воздействия ЭСК в форме освещения были получены аналогичные результаты: 148 ± 25,9 мВ/5 x 105клеток после 10-минутной обработки против 231 ± 17,5 мВ/5 x 105клеток для контроля (среднее ± стандартное отклонение по 6 различным донорам клеток, p=0,002). Изучение зависимости от времени инкубации моноцитов под действием ЭСК (2, 5, 10 и 15 мин) показывает, что после 2 мин достигается 60% антиоксидантный эффект. Выдержка клеток на льду в течение 4 часов не оказывает влияния на их жизнеспособность, но эффект воздействия синглетного кислорода ослабевает уже после 1 часа и почти исчезает после 2 часов. Наблюдавшееся снижение продукции свободных радикалов моноцитами, по-видимому, не было следствием снижения их жизнеспособности, поскольку жизнеспособность сохранили 91 ± 0,9% клеток, подвергнутых воздействию синглетного кислорода, и 90 ± 1,8% (n=3) контрольных.
В бесклеточной среде влияние ЭСК не проявляется. Пиковые значения ХЛ после 10 мин обработки составили 0,826 мВ против 0,814 мВ для контрольного образца.
Для определения относительного вклада в ХЛ различных метаболитов кислорода могут применяться различные радикальные ловушки и ингибиторы. Например, СОД и каталаза позволяют устранить супероксид-анионы и пероксид водорода соответственно. Поскольку эти ферменты представляют собой белковые макромолекулы, они действуют только на внеклеточные АФК. При добавлении СОД или каталазы к клеткам, обработанным синглетным кислородом, никаких отличий от контрольных клеток в интенсивности ХЛ под действием ФМА обнаружено не было (см. рис. 3). При добавлении каталазы в контрольный образец реакция на ФМА стала слабее на 30%. Наиболее выраженный ингибирующий эффект дала СОД (90%), что свидетельствует о важной роли супероксид-аниона в стимулированной люминолом ХЛ. Отсутствие различий в интенсивности ХЛ между контрольным и обработанным ЭСК образцами в присутствии СОД или каталазы позволяет предположить, что ЭСК подавляет активность НАДФН-оксидазы — одного из основных источников супероксид-аниона.
Детекторные молекулы изолюминола не могут проникать через клеточные мембраны, поэтому обнаруживаются только внеклеточные метаболиты кислорода [9]. Поскольку добавление СОД и каталазы устраняет антиоксидантный эффект ЭСК, можно предположить, что обработка активированным воздухом или оптическим излучением снижает продукцию как супероксид-анионов, так и пероксида водорода.
Обсуждение
Цель исследования состояла в изучении влияния обработки ЭСК путем облучения светом с длиной волны 634 нм либо пропускания ЭСК-воздуха на продукцию активных форм кислорода человеческими моноцитами с активированной НАДФН-оксидазой. Кратковременное воздействие ЭСК (в течение 2 минут) приводит к значительному снижению продукции супероксид-аниона и пероксида водорода по сравнению с контролем. Световое облучение моноцитов и пропускание воздуха оказывают сходное влияние на ХЛ. Наиболее ярко эффект проявляется на самых молодых клетках (менее 1 ч после выделения). Никакого влияния обработки ЭСК на жизнеспособность клеток не выявлено, что позволяет считать условия эксперимента физиологическими. Описанное энергетическое воздействие снижает окислительный стресс благодаря подавлению дыхательного скачка в моноцитах с активированной НАДФН-оксидазой.
Полученные результаты позволяют говорить, что обработка ЭСК путем пропускания воздуха или светового облучения может снижать продукцию активных форм кислорода моноцитами, ограничивая таким образом повреждение тканей при реперфузии и воспалении.
Активные метаболиты кислорода, генерируемые НАДФН-оксидазой фагоцитов, играют критически важную роль в иммунных реакциях. В то же время эти высокотоксичные окислительные агенты могут вызывать серьезные повреждения тканей при воспалительных процессах и постишемической реперфузии, поэтому важно строго контролировать процессы их продукции и инактивации.
Обычно НАДФН-оксидаза находится в неактивном состоянии, но может быть активирована ФМА, что ведет к образованию супероксид-анионов. Известно, что супероксид и пероксид водорода могут образовываться с участием НАДФН-оксидазы во внутриклеточной среде. Далее происходит ряд вторичных реакций, опосредующих их токсическое действие: дисмутация супероксида с участием супероксид-дисмутазы, образование
При обратной релаксации синглетного кислорода, образовавшегося в результате возбуждения основного состояния молекулы, энергия преобразуется в колебания растворителя. Непосредственный переход
Синглетный кислород может существовать в нескольких состояниях, для которых характерно излучение с длиной волны 381, 476, 634, 762 или 1269 нм. По литературным данным, чаще всего наблюдается излучение при 634 и 1269 нм. Эти две длины волны участвуют в реакциях в биологических средах. Излучение с длиной волны 634 нм способно проникать через стекло, поэтому мы полагаем, что в использованном оборудовании наблюдаемые эффекты обусловлены именно им, а не излучением 1269 нм.
То парадоксальное обстоятельство, что синглетный кислород — высокоактивная электрофильная частица — оказывает антиоксидантное действие, можно объяснить инактивацией НАДФН-оксидазы. Следует отметить, что такой эффект наблюдается в узком диапазоне доз. Кроме того, предполагается, что воздействие небольших доз синглетного кислорода изменяет поведение клеток, тогда как высокие дозы цитотоксичны [17].
Известно, что видимый и ультрафиолетовый свет малой интенсивности вызывает в клетках определенные фотобиологические процессы [7, 18, 19]. Фотоны ЭСК могут подводиться к биологическому образцу от источника света с длиной волны 634 нм по оптическому волокну. Существует определенная связь между нашими результатами и фотодинамической терапией (ФДТ), предлагаемой для лечения артериосклероза [20, 21], рестеноза после ангиопластики [22 — 25], а также злокачественных новообразований []. При переходе синглетного кислорода в стабильное состояние испускаются фотоны ЭСК. В то же время при ФДТ происходит образование синглетного кислорода, что отчасти обуславливает ее деструктивное влияние на биологические системы. Конкретные механизмы ФДТ остаются пока невыясненными, однако, по всей вероятности, ключевую роль играет образование цитотоксичных оксидантов, таких как синглетный кислород.
Было показано, что при ФДТ происходит селективное подавление гиперплазии интимы в клетках гладкой мускулатуры сосудов. Мы предполагаем, что другие клетки стенки артерии могут быть защищены от цитотоксических эффектов оксидантов, образующихся с участием фотофрина или 5-аминолевулиновой кислоты. Для получения эффекта
Таким образом, мы приходим к выводу, что обработка человеческих моноцитов ЭСК снижает продукцию ими АФК с участием НАДФН-оксидазы. Это может иметь существенное значение для объяснения положительного эффекта ФДТ при рестенозе после ангиопластики. Установление положительного эффекта обработки ЭСК на клеточном урове может иметь широкий спектр медицинских применений в ситуациях, связанных с окислительным стрессом.
Благодарности.
Авторы искренне благодарят за полезное обсуждение профессора Яна Рюдстрёма (JanRydström), Анн-Кристин Бюлунд (Ann-ChristinBylund), Йохана Хобекке (JohanHobecke) и ныне покойного профессора Ларса Эрнстера (LarsErnster). Мы также благодарим г-на Тони ван дер Валка (TonyvanderValk) за предоставленную аппаратуру Valkion. Работа выполнена при поддержке Шведского совета медицинских исследований (проект № 536), Национального фонда сердца и легких, Фонда Валленберга, Фонда Инги-Бритт и Арна Лудбергов и Фонда Сальгренской университетской больницы.
Блок катализа, используемый для получения синглетного кислорода в аппаратуре Valkion, изобретен Йоргом Клеммом (JörgKlemm) из немецкой компании NaturalenergysolutionsAG. 
 
Литература
[1] Briviba, K.: Klorz, l-O.: Sics, H. Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biological systems. Bio. Chem. 378:1259-1265: 1997
[2] Halliwell, B.: Gutteride, J.M.: Cross, C.E. Free radicals, antioxidants, abd human disease: where are we now ? J. Lab. Clin. Med. 119 :598-520 :1992
[3] Palmer, H J. Paulson; E.K. Reactive oxygen species and antioxidants in signal transduction and gene expression. Nurr.Reviews 55:353-361; 1997
[4] Lagerwall; K.: Daneryd, P.: Schersten, T..: Soussi. B. In vivo 31P nuclear magnetic resonance evidence of the salvage effect of ascorbate on the postischemic reperfusion rat skeletal muscel. Life Science 56:389-397; 1995 [5] Lagerwall; K.: Madhu, B.; Daneryd, P.: Schersten, T.; Soussi. Purine nucleorides and phospholipids in ischemic and reperfused rat skeletal muscle: effect of ascorbate. Am. J. Physiol. 272 (Heart Circ. Physiol. 41): H83-H90;1997
[6] Sorensen, V.: Jonsson, O.: Pettersson, S.: Scherstein, T.; Soussi, B. In vivo 31P NMR OSIRIS of bioenergetc changes in rabbit kidneys during and after ischemia: effect of pretreatment with an indeno-indole compund. Physiol. Scand. 162:495-500; 1998
[7] Grether-Beck, S.; Buettner, R.; Krutman, J. Ultraviolet A radiation-induced expression of human genes: molecular and photobiological mechanism. Bio. Chem. 378:1231-1236; 1997
[8] Johansson, A.; Dahlgren, C. Characterization of the luminol-amplified light-generating reaction induced in human monocytes. J.Leucocyte Biol. 45:444-451; 1989.
[9] Lundqvist, H.; Dahlgren, C. Isoluminol-enhanced chemiluminescence: a sensitive method to study the release of superoxide anion from human neutrophils. Free Radical Biol. Med 20:785-792; 1996
[10] Böum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and monocytes. Scand. J.Immunol. 5:9-15 ; 1976.
[11] Nielsen, H. Isolation and functional activity of human blood monocytes after adherence to plastic surface: comparison of different detachment methods. Acta Path. Microbio. Immunol. Scand. 95:81-84; 1987.
[12] Wilkinson, F.; Helman, W.P.; Ross, A.B. Quantum yields for the photosensitized formation of the lowest electronically excited singlet state of molecular-oxygen in solution. J. Phys. Chem. Ref. Data 22:113-262; 1986.
[13] Rossi, F. The O2 – forming NAaDPHoase otphatoctes: nature, mechanisms of activation and function. Biochem. Biophys. Acta 853:65-89; 1986
[14] Klebanoff, S.J. Oxygen metabolism and the toxic properties of phatogocytes. Ann. Int. Med. 93:480-489; 1980
[15] Kirchenbaum, P. H.: ed. Atlas of protein spectra in the UV visible regions.New York, Washington, London: IFI/Plenum Press; 1972.
[16] Frimer, A., ed. Singlet O2, vol 1: physical-chemical aspects. Boca Raton, FL: CRC Press; 1985
[17] Rowe, P. M.Photodynamic therapy begins to shine. Lancet 351: 1496; 1998
[18] Ocana Quero, J.M.: Gomez-Villamandos, R.; Moreno-Millan, M.; Santisteban-Valenzuela, J. M. Sister chromatid exchange induction in sheep peripheral blood mononuclear cells by helioneon laser radiation. Mutat. Res. 377:69-75; 1997.
[19] Chen, W. R.; Adams, R. L.; Carubelli, R.; Nordquist, R. E. Laser-photosensitizer assisted immunotherapy: a novel modality for cancer treatment. Cancer Lett. 115:25-30; 1997.
[20] Spears, J.R.; Serur, J.; Shropshire, D.; Paulin, S. Flourescence of experimental atheromatous plaques with hematoporhyrin derivate. J.Clin. Invest. 71:395-399; 1983.
[21] Neave, V.; Gianotta, S.; Hyman, S.; Schneider, J. Hematoporhyrin uptake in atherosclerotic plaques: therapeutic potentials. Neurosurgery 23:307-312; 1988.
[22] Eton, D.; Colburn, M. D.; Shim, V.; Panek, W.; Lee, D.; Moore, W. S.; Ahn S. S. Inhibition of intimal hyperplasia by photodynamic therapy using photofrin. J. Surg. Res. 53 :558-562 ; 1992.
[23] LaMuraglia, G. M.; Chandra Sekar, N. R.; Flotte T. J.; Abbott, W. M.; Michaud, N.; Hasan, T. Photodynamic therapy inhibition of experimental intimal hyperplasia: acute and chronic effects. J. Vasc. Surg. 19 :321-331, 1994.
[24] Nyamekye, I. ; Anglin, S.; McEwan, J.; MacRobert, A.; Bown, S.; Bishop, C. Photodynamic therapy of normal and ballooninjured rat carotid arteries using 5-amino-levulinic. Acid. Circulation 91:417-425; 1995
[25] Sluiter, W.; de Vree, W. J. A. ; Pieterasma, A. ; Koster, J.F. Prevention of late lumen loss after coronary angioplasty by photodynamic therapy: role of activated neutrophiles. Mol. Cell Biochem.157:233-238; 1996
[26] Dougherty, T. J.; Gomer, C. J.; Henderson, B. W.; Jori, G.; Kessel, D.; Korbelik, M.; Moan, J.; Peng, Q, Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer. Inst. 90:889-905; 1998.